Soziales Netzwerken am Eingangstor der Zelle

Forschende decken Proteinarchitektur der zellulären Stoffaufnahme auf

17. September 2020

Die rezeptorbasierte Aufnahme von Nährstoffen und Signalen (Clathrin-vermittelte Endozytose) ist für das Wachstum und die Kommunikation von Zellen unerlässlich, und zudem ein Einfallstor für Zellgifte und Viren. Ein Forscherteam unter der Leitung von Michal Skruzny analysierte erstmals die unmittelbare räumliche Nähe der beteiligten Proteine zueinander. Ihre Ergebnisse zeichnen ein neues Bild der hochkomplexen, modularen und temporären Transportmaschinerie, und führen zu einem besseren Verständnis von Transportprozessen und ihrer Regulation.

FRET-basiertes Protein-Proximity-Mapping zeigt die Organisation des Kerns der endocytischen Maschinerie im Nanomaßstab. Hüllproteine bilden mehrere funktionelle Schichten ober- und unterhalb des Clathrin-Geflechts. Die zentralen endocytischen Faktoren sind nicht, wie bislang angenommen, zufällig platziert, sondern erstrecken sich durch das Clathringeflecht bis in das Zellinnnere (rot).

Alle Zellen, ob ein relativ einfacher Hefe-Mikroorganismus oder solche des komplexen menschlichen Gewebes, nehmen Signale und Nährstoffe aus ihrer Umgebung auf. Darüber hinaus müssen sie ihre Plasmamembran, die sie von der Umgebung abschirmt, beständig erneuern. Für diese Aufgaben ist primär die Clathrin-vermittelten Endozytose (CME) verantwortlich. Bei diesem Prozess faltet sich ein kleiner Bereich der Plasmamembran nach innen, so dass eine kugelförmige Struktur entsteht, ein so genanntes endocytisches Vesikel. In seinem Inneren transportiert es Nährstoffe, Signale und Membranen in die Zelle, aber auch Giftstoffe oder Viren.

Die Herstellung eines endocytischen Vesikels ist diffiziles Kunstwerk und höchst anspruchsvolle Arbeit zugleich, da sich die Plasmamembran nicht leicht biegen lässt. Daher ist es nicht verwunderlich, dass in dieser komplexen Maschinerie Trupps von mehr als 50 Proteinen zusammenarbeiten. Während frühere Studien eine recht umfassende Liste der beteiligten „Mitarbeiter“ lieferten, blieb die Proteinarchitektur der Maschinerie nur unzureichend verstanden. Diese Kenntnisse sind jedoch wichtig, um zu verstehen, wie die Endozytose in gesunden Organismen und bei Krankheiten funktioniert. Einige Beispiele für hierauf aufbauende Forschungsfelder sind die Manipulation des Apparates für eine optimierte Wirkstoffabgabe, die gezielte molekulare Aufnahme von toxischen oder auch wertvollen Verbindungen, oder ein besseres Verständnis davon, wie Viren durch „Kapern“ des CME-Apparates in die Zelle gelangen.

Bei hoher Proteindichte kommt FRET zum Einsatz

Abb. 2:  FRET zwischen endozytären Proteinen zeigt deren enge Nachbarschaft an. Zwei endozytäre Proteine Ent2 und Sla1 wurden mit GFP bzw. mCherry Fluoreszenz-markiert. Sie befinden sich an endozytären Stellen, kleinen Flecken unterhalb der Plasmamembran einzelner abgerundeter Hefezellen. Ein helleres Fluoreszenzsignal von Ent2-GFP nach Akzeptor-Photobleaching zeigt an, dass die Moleküle dieser beiden Proteine nicht weiter als 5-10 nm voneinander entfernt sind. Die Fluoreszenzintensitäten sind im Smart-Pseudofarbschema dargestellt (rechter Balken); Skalenbalken, 2 μm.

Die Analyse der Proteinorganisation dieses zellulären Bereiches gestaltet sich normalerweise schwierig, denn alle Proteine sind in einem sehr kleinen Bereich (in einem Radius von circa 50 Nanometern) zusammengepackt, der für die meisten Lichtmikroskopie-Techniken nicht zugänglich ist. Für die Forschenden des Max-Planck-Instituts für terrestrische Mikrobiologie war die hohe Proteindichte jedoch eher von Vorteil: Die Gruppe um Michal Skruzny arbeitet mit FRET-Mikroskopie, einer hochauflösenden Methode, mit der man Protein-Protein-Näherungen bestimmen kann. Das photo-physikalische Phänomen des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) kann zwischen zwei fluoreszenzmarkierten Proteinen nur dann auftreten, wenn sie nahe beieinanderliegen (typischerweise weniger als 10 Nanometern), und wird als Fluoreszenzverlust oder Fluoreszenzgewinn eines der beiden Proteine gemessen (Abb. 2). Detektierte Fluoreszenzveränderungen können daher zuverlässig Proteinannäherungen anzeigen und die Proteinnachbarschaften innerhalb der Zelle abbilden.

Endocytäre Proteine sind nicht zufällig platziert, sondern bilden ein Netzwerk

Abb.3: Vereinfachtes Modell des konservierten endocytischen Mantels. Links: In der traditionellen Ansicht sollten die Hüllproteine im Inneren des Clathrinkäfigs verankert sein, um ihn mit der Plasmamembran zu verbinden. Rechts: Nach unserer Studie erstrecken sich wichtige Hüllproteine durch den Clathrinkäfig und interagieren mit dem Aktin-Zytoskelett im Inneren der Zelle.

Die Forscher nutzten die Methode, um die Abstände von 18 wichtigen endocytischen Proteinen zu kartieren – diese Proteine werden vielen Organismen, einschließlich des Menschen, geteilt. Sie konstruierten mehr als 200 Hefestämme mit einzelnen fluoreszenzmarkierten Proteinpaaren, von denen über 50 Paare FRET-Signale zeigten. "Mit unserem Ansatz konnten wir ein "soziales Netzwerk" des endozytären Bereiches zeichnen", erklärt Michal Skruzny. "Bislang wurde angenommen, dass die endozytären Proteine zufällig zwischen der Membran und einem so genannten Clathrinkäfig platziert sind. Doch überraschenderweise ist das Gegenteil der Fall: Wir stellten fest, dass die Hülle in mehreren Schichten organisiert ist und dass die wichtigen endocytären Proteine durch das Clathrin hindurch ins Zytoplasma ragen. Hier interagieren sie funktionell mit den Aktin-Filamenten, die das endocytische Vesikel ins Zellinnere ziehen." (Abb. 1; 3).

Ein neu entwickeltes FRET-Protokoll verriet sogar noch mehr: Einige Proteine ordnen sich im Laufe der Endozytose neu an. Zum Beispiel ist ein endozytäres Protein zunächst im Inneren der Clathrinhülle verborgen - später im Verlauf der Endozytose, wenn das Aktin in der Nähe ist, ragt es aus ihr heraus.

Ein methodischer Rahmen für Multiprotein-Analysen

Insgesamt hat das Forschungsteam die Architektur des Kernteils der endocytischen Maschinerie im Detail und auf Nano-Ebene bestimmt. Durch ihre Ergebnisse  ermutigt, wollen sie damit weiter voranschreiten, um die andere bedeutsame Proteingruppe der endozytären Stelle, die Proteine des WAS/Myo-Komplexes, zu kartieren. Obwohl diese „Arbeiter“ erst sehr spät zum endocytischen Ereignis hinzukommen, können ohne ihr Mitwirken keine Aktin-Filamente und in der Folge keine endocytischen Vesikel hergestellt werden. Dazu Michal Skruzny: "Wir glauben, dass unsere Studie wesentlich zum mechanistischen Verständnis des endozytischen Prozesses und seiner Regulation beitragen wird. Darüber hinaus bieten die von uns entwickelten FRET-Mikroskopietechniken einen starken methodischen Rahmen für die Charakterisierung von Multiprotein-Anordnungen, wie sie auch an anderen grundlegenden zellulären Prozessen beteiligt sind."

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