Denitrifikation: Mikrobielle Gemeinschaften und ihre Funktion in der Umwelt

Forschungsbericht (importiert) 2005 - Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie

Autoren
Braker, Gesche
Abteilungen
Biogeochemie (Conrad) (Prof. Dr. Ralf Conrad)
MPI für terrestrische Mikrobiologie, Marburg
Zusammenfassung
Denitrifizierende Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle im globalen Stickstoffkreislauf. Die Denitrifikation ist einer der Hauptprozesse innerhalb dieses Kreislaufs und löst durch die Produktion von Treibhausgasen klimatische Effekte aus. Neue Erkenntnisse über Denitrifiziererpopulationen wurden auf dem Gebiet der mikrobiellen Ökologie gewonnen. Sie sind die Grundlage, Beziehungen zwischen Struktur und Funktion von Denitrifiziererpopulationen und den Einfluss von Umweltparametern auf die Entwicklung und Aktivität dieser Gemeinschaften in natürlichen Habitaten zu verstehen.

Einleitung

Denitrifikation (eine spezielle Form der dissimilatorischen Nitratreduktion) ist eine alternative anaerobe Atmung, die ausschließlich von Mikroorganismen zur Energiegewinnung genutzt werden kann. Unter Denitrifikation im eigentlichen Sinne wird die Reduktion oxidierter Stickstoffverbindungen wie Nitrat (NO3-) und Nitrit (NO2-) zu den gasförmigen Produkten Stickstoffmonoxid (NO), Distickstoffoxid (N2O) und elementarem Stickstoff (N2) verstanden. Die Einzelschritte werden durch vier Reduktasen (Nitrat-, Nitrit-, NO- und N2O-Reduktase) katalysiert (Abb. 1).

Der Prozess der Denitrifikation. Farbig unterlegt sind die Enzyme, die die Einzelschritte katalysieren. Vertikale Pfeile zeigen gasförmige Zwischen- und Endprodukte an.

Die Denitrifikation vervollständigt den Stickstoffkreislauf. Einerseits nutzt sie als Substrat Nitrat, das Endprodukt der mikrobiellen Oxidation von Ammoniak (Nitrifikation), andererseits bildet sie mit N2 das Ausgangssubstrat für die Fixierung von Stickstoff (Abb. 2). Daher spielt die Denitrifikation eine entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung eines ausbalancierten globalen Stickstoffhaushalts.

Industriell wird die Denitrifikation in Klärwerken zur Eliminierung von Stickstoff aus Abwässern genutzt. Reduziertes Wachstum landwirtschaftlich genutzter Pflanzen wiederum ist eine unerwünschte Folge der Denitrifikation, da sie den durch Düngung in den Boden eingebrachten Nährstoff Nitrat entfernt und als Gase in die Atmosphäre abgibt. Die dabei gebildeten gasförmigen Produkte tragen entscheidend zum Klimawandel bei. Denitrifikationsprozesse in Böden sind die Hauptquelle von atmosphärischem N2O und verursachen ungefähr 57% der globalen Emission. N2O ist ein starkes Treibhausgas mit einem 300-mal höheren globalen Erwärmungspotenzial als CO2 und trägt zur Erwärmung der Erdatmosphäre und zur Zerstörung der Ozonschicht in der Stratosphäre bei.

Biologischer Stickstoffkreislauf, vereinfacht dargestellt. Farbig unterlegt sind die wichtigsten Ausgangssubstanzen beziehungsweise Produkte im Stickstoffkreislauf. Org., organisch.

Um Denitrifikationsprozesse in der Natur zu verstehen und auf lange Sicht eventuell beeinflussen zu können, ist nicht nur die Kenntnis des Prozesses an sich, sondern auch der Mikroorganismen notwendig, die dafür verantwortlich sind. Das Wissen darüber, um welche Organismen es sich handelt und wie sie in der Umwelt funktionieren, ist jedoch noch sehr begrenzt.

Denitrifizierende Mikroorganismen

Reinkulturen von Denitrifizierern im Labor sind hauptsächlich der Domäne der Bakteria zuzuordnen. Von den kultivierten Stämmen der Bakteria insgesamt sind wiederum ungefähr 50% zur Denitrifikation befähigt. Jedoch wurden auch unter den Archaea und den Pilzen Organismen gefunden, die denitrifizieren können. Diese Fähigkeit ist also weit verbreitet und beschränkt sich nicht auf eine engverwandte Gruppe. Die Gruppe der Denitrifizierer lässt sich also nur über diese spezielle physiologische Fähigkeit definieren, nicht jedoch über ihre stammesgeschichtliche Einordnung.

Analyse von Denitrifiziererpopulationen in der Umwelt mit molekularbiologischen Techniken. Aus Umwelt-DNA (1) werden Markergene, z.B. Nitritreduktasegene, durch PCR amplifiziert (2). Der Genpool wird durch Klonierung vereinzelt, sequenziert, und die Sequenzen werden in den Stammbaum eingerechnet (3). Alternativ werden PCR-Produkte für T-RFLP-Analysen (Terminaler Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus) durch Restriktionsenzyme fragmentiert, aufgetrennt und markierte terminale Fragmente sichtbar gemacht (4). Relative Häufigkeiten der Fragmente werden aus den Signalstärken des T-RFLP-Profils berechnet (5). Experimentell beobachtete und berechnete Fragmente von Sequenzen aus dem Stammbaum werden korreliert (6).

Reinkulturen zur Untersuchung von Mikroorganismen-Gemeinschaften erfassen jedoch bekanntermaßen nur einen Bruchteil der Diversität von in der Umwelt auftretenden Organismen. In der letzten Dekade wurden molekularbiologische Ansätze, die auf der Detektion von Genen für die vier Reduktasen (Abb. 1) mittels PCR beruhen, entwickelt. Damit lassen sich Denitrifizierer direkt in ihrem Habitat erfassen, ohne sie vorher in Kultur nehmen zu müssen (Abb. 3 und [7]). Die Detektionssysteme basieren zum Beispiel auf den Genen für die Nitritreduktase [4], die als Schlüsselenzym der Denitrifikation gilt, da alle weiteren Produkte des Prozesses gasförmig sind und somit nicht von den Organismen assimiliert werden können.

Diversität von Denitrifizierern in der Umwelt

Molekularbiologische Untersuchungen verschiedenster Habitate haben eine immense Vielfalt von Denitrifizierern aufgezeigt, die weit über die bislang bekannter kultivierter Denitrifizierer hinausgeht. Diese neuartigen Denitrifikanten sind mit den kultivierten Vertretern teilweise nur sehr entfernt verwandt (Abb. 4 und [2, 5, 8]). Dennoch zeigen statistische Analysen, dass die bislang beobachtete Diversität bei weitem noch nicht die gesamte Vielfalt abdeckt [2, 5, 8].

Stammbaum ausgewählter Nitritreduktasegene. Schwarz, Gene von kultivierten Denitrifizierern; grün, Gene, die aus Böden kloniert wurden. Der Balken gibt eine Differenz von 10 % zwischen zwei Sequenzen an.

Es ist auch möglich, dass die bisher publizierten Detektionssysteme nur eine begrenzte Vielfalt an Organismen erfassen. Die Entwicklung spezifischer Detektionssysteme ist stets durch die Vielfalt der Gensequenzen begrenzt, die in Datenbanken gespeichert sind. Allerdings werden kontinuierlich weitere Denitrifikationsgene aus Reinkulturen sequenziert. Anhand dieser erweiterten Datenbasis können auch die Detektionssysteme für Denitrifizierer verbessert werden, sodass in Zukunft eine umfangreichere Erfassung möglich sein wird.

Struktur von Denitrifiziererpopulationen

Denitrifiziererpopulationen in Umweltproben werden häufig mittels so genannter ‚fingerprint’-Verfahren wie dem Terminalen Restriktionsfragmentlängen Polymorphismus (T-RFLP) untersucht (Abb. 3). Dafür werden zunächst entsprechende Genfragmente, zum Beispiel der Nitritreduktasegene, durch PCR aus dem Genpool der Umwelt-DNA amplifiziert. Anschließend werden die Amplifikate durch ein Restriktionsenzym fragmentiert und der Länge nach aufgetrennt. Detektiert werden aber nur die terminalen Fragmente, da sie während der PCR mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden. Die Stärke der Signale für einzelne terminale Fragmente lässt sich als relative Häufigkeit eines Genfragments innerhalb einer Population beschreiben, und die Gesamtheit der Signale gibt somit die Vielfalt und Zusammensetzung der Denitrifizierergemeinschaft im Ökosystem wieder. Terminalen Fragmenten in den T-RFLP-Profilen von Umweltproben können durch computergestützte Analysen Fragmente von Datenbanksequenzen zugeordnet werden [9]. T-RFLP-Analysen erlauben die Bearbeitung einer großen Anzahl von Proben und ermöglichen so vergleichende Analysen von Populationen entlang von Umwelt- und Zeitgradienten oder nach Inkubationsversuchen.

In der Umwelt stellen die Denitrifizierer, die bereits aus Kultivierungsversuchen bekannt sind, anteilsmäßig nur eine unbedeutende Gruppe dar. Dominant hingegen sind bislang nicht kultivierbare Mikroorganismen mit neuartigen Denitrifikationsgenen, jedoch unbekannter verwandtschaftlicher Zugehörigkeit [1, 3, 6, 8]. Sie sollen durch neuartige Kultivierungsverfahren, die in letzter Zeit entwickelt wurden und die die nährstoffarme Umwelt dieser Organismen zu imitieren versuchen, in Kultur genommen werden. Für diese Reinkulturen kann dann nicht nur die verwandtschaftliche Zugehörigkeit ermittelt, sondern es können auch physiologische Eigenschaften der Organismen untersucht werden.

Was treibt Struktur und Aktivität von Denitrifizierergemeinschaften?

Verfügbarkeit von Sauerstoff, Nitrat, organischem Kohlenstoff, der pH-Wert und die Temperatur der Umgebung sind Faktoren, die sowohl die Aktivität als auch die Entwicklung von Denitrifizierergemeinschaften steuern. Substratverfügbarkeit wird unter anderem durch Interaktionen mit anderen Organismen im Habitat beeinflusst. Diese Interaktionen sind interessant, aber nur teilweise verstanden, da es sich um komplexe Beziehungen handelt. Ein Beispiel für Interaktionen zwischen Mikroorganismen ist die Verflechtung von Denitrifikation und Nitrifikation über Nitrat als Endprodukt der Nitrifikation beziehungsweise als Ausgangssubstrat der Denitrifikation. So erhöht eine Düngung des Bodens mit steigenden Mengen Ammoniumstickstoff nicht nur die Aktivität, sondern verändert auch die Populationen der Denitrifizierer. Ammoniak wird durch die Aktivität nitrifizierender Bakterien zu Nitrat oxidiert (Abb. 2), das dann als Ausgangssubstrat für die Denitrifikation zur Verfügung steht. Steigende Ammoniakkonzentrationen führen zu einer Erhöhung der Oxidationsraten und über eine vermehrte Bereitstellung von Nitrat zu einer Dominanz von Denitrifizierern, die es effektiv zur Energiegewinnung nutzen können. Die damit verbundene Aktivitätserhöhung führt dann wiederum zu beschleunigtem Nitratverlust und gesteigerter Treibhausgasemission aus dem Boden [1].

Noch komplexer als Interaktionen zwischen Mikroorganismen sind solche zwischen Mikroorganismen und Pflanzen. Man nimmt an, dass mikrobielle Diversität und die Diversität der Vegetation korreliert sind. Das heißt, eine diversere Vegetation bedingt eine komplexere Denitrifizierergemeinschaft. Weiterhin geht man davon aus, dass diversere Gemeinschaften effizienter funktionieren als weniger diverse. Damit würde die Diversität der Planzengemeinschaft sowohl die Zusammensetzung als auch indirekt die Funktion der Denitrifizierergemeinschaft im Boden beeinflussen. Diese Hypothese wurde für Denitrifiziererpopulationen aus Böden von Modellökosystemen, die mit verschiedenen Planzenarten und in verschiedenen Pflanzendiversitätsstufen bepflanzt wurden, getestet. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Annahmen beeinflussten jedoch nicht die Diversität des Pflanzenbewuchses, sondern die Artzusammensetzung Struktur und Funktion der Denitrifizierergemeinschaft. Dabei dürften sowohl die Wurzelbiomasse als auch Nährstoffe, die von den Wurzeln an den Boden abgegeben oder frei werden, wenn die Wurzeln absterben, eine entscheidende Rolle spielen. Auch die Konkurrenz um Nährstoffe zwischen Pflanzen und Mikroorganismen könnte wichtig sein. Wurzelbiomasse, Nährstoffart und -menge werden wesentlich durch die Pflanzenart mitbestimmt. Trotz des deutlichen Einflusses der Vegetation war die Zusammensetzung der Denitrifizierergemeinschaft unter verschiedenen Pflanzenmonokulturen jedoch erstaunlich konstant, da die dominierenden Denitrifizierer im Wesentlichen dieselben waren. Nur ein geringerer Teil der Gemeinschaft war charakteristisch für eine Pflanzenart (Abb. 5).

Struktur der Denitrifizierergemeinschaft im Boden am Beispiel von Monokulturen der typischen Grünlandpflanzen Wolliges Honiggras (Holcus lanatus) und Spitzwegerich (Plantago lanceolata). A) Gezeigt ist die relative Häufigkeit von Fragmenten der Nitritreduktasegene nach T-RFLP-Analyse. Grau gemusterte Fragmente repräsentieren Denitrifizierer, die in allen Proben vorkommen, schwarz gemusterte solche, die mit nur einer Pflanzenart assoziiert sind. Die Legende gibt die Größe der Restriktionsfragmente in Basenpaaren (bp) an. B) Monokulturen typischer Grünlandpflanzen (Daten und Photo: C. Bremer, MPI Marburg).

Allerdings kann nur auf einer Analyse der Populationsstruktur basierend nicht geklärt werden, welche Denitrifizierer für die Aktivität im Boden verantwortlich sind. Die Populationsstruktur beschreibt eher das genetische Potenzial einer Gemeinschaft, zu denitrifizieren. Der Prozess selbst wird wahrscheinlich nur von wenigen Mitgliedern der Population ausgeführt. Welche Denitrifizierer jeweils aktiv sind, wird durch die sich stets verändernden Umweltbedingungen bestimmt. Um den Prozess der Denitrifikation in Öksystemen besser zu verstehen, soll sich unsere zukünftige Forschung mit folgenden Fragestellungen befassen: 1) welche Denitrifizierer nehmen eine relevante Funktion in einem Habitat wahr, 2) wodurch ist die Denitrifikation auf molekularer Ebene reguliert und 3) wie wird dieser Prozess von Umweltfaktoren beeinflusst? Die Beantwortung dieser Fragen wird letztendlich die Grundlage sein, Strategien zu entwickeln, um die Denitrifikation zu beeinflussen und somit sowohl die industrielle Nutzung zu optimieren als auch die Treibhausgasproduktion zu minimieren.

Originalveröffentlichungen

1.
Avrahami, S., R. Conrad, and G. Braker:
Effect of soil ammonium concentration on N2O release and on the community structure of ammonia oxidizers and denitrifiers.
Applied and Environmental Microbiology 68, 5685-5692 (2002).
2.
Braker, G., and J. M. Tiedje:
Nitric oxide reductase (norB) genes from pure cultures and environmental samples.
Applied and Environmental Microbiology 69, 3476-3483 (2003).
3.
Braker, G., H. L. Ayala-del-Rio, A. H. Devol, A. Fesefeldt, and J. M. Tiedje:
Community structure of denitrifiers, Bacteria, and Archaea along redox gradients in Pacific Northwest marine sediments by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of amplified nitrite reductase (nirS) and 16S rRNA genes.
Applied and Environmental Microbiology 67, 1893-1901 (2001).
4.
Braker, G., A. Fesefeldt, and K.-P. Witzel:
Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples.
Applied and Environmental Microbiology 64, 3769-3775 (1998).
5.
Braker, G., J. Zhou, L. Wu, A. H. Devol, and J. M. Tiedje:
Nitrite reductase genes (nirK and nirS) as functional markers to investigate diversity of denitrifying bacteria in Pacific Northwest marine sediment communities.
Applied and Environmental Microbiology 66, 2096-2104 (2000).
6.
Castro-González, M., G. Braker, L. Farías, and O. Ulloa:
Communities of nirS-type denitrifiers in the water column of the oxygen minimum zone in the eastern South Pacific.
Environmental Microbiology 7, 1298-1306 (2005).
7.
Hallin, S., G. Braker, and L. Philippot:
Molecular tools to assess the diversity and density of denitrifying bacteria in their habitats.
In: H. Bothe, S. J. Ferguson and W. E. Newton (Eds.), Molecular biology, biochemistry, ecology, and applied aspects of the nitrogen cycle. Elsevier Publishers 2006.
8.
Priemé, A., G. Braker, and J. M. Tiedje:
Diversity of nitrite reductase (nirK and nirS) gene fragments in forested upland and wetland soils.
Applied and Environmental Microbiology 68, 1893-1900 (2002).
9.
Ricke, P., S. Kolb, and G. Braker:
Application of a newly developed ARB software-integrated tool for in silico terminal restriction fragment length polymorphism analysis reveals the dominance of a novel pmoA cluster in a forest soil.
Applied and Environmental Microbiology 71, 1671-1673 (2005).
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