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Die Beobachtung einzelner Proteine bei deren Arbeit in lebenden Zellen

Die Beobachtung einzelner Proteine bei deren Arbeit in lebenden Zellen  

23. Juni 2017

Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie haben ein neuartiges Verfahren für die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) entwickelt, in dem ein kürzlich beschriebener neuer Photokonversionsmechanismus Verwendung findet, der sich gezielte Konversion [primed conversion] nennt. Von der neuen Methode verspricht man sich, dass sie neue Einsichten in die räumliche Organisation von Zellen und deren Makromolekülen ermöglicht. Die Ergebnisse würden vor Kurzem in der Zeitschrift „Angewandte Chemie“ veröffentlicht.

Alle Zellen sind räumlich äußerst organisiert und verfügen über verschiedene Makromoleküle, die dynamisch einer spezifischen subzellulären Adresse zugeordnet sind. Eine wichtige Methode zur Erforschung dieser Organisation macht sich die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der PALM-Technik zu Nutze. Dabei wird die Fluoreszenz einer bestimmten Gruppe fluoreszierender Proteine, der sogenannten photoaktivierbaren bzw. photokonvertierbaren Proteine, aktiv mittels Bestrahlung mit UV-Licht gesteuert. Obwohl UV-Licht keine negativen Auswirkungen auf feste Stichproben hat, verursacht es in Experimenten mit lebenden Zellen, z. B. bei Studien zur PALM-Einzelpartikelverfolgung, Phototoxizität.

<p style="text-align: justify;">Single-molecule trajectories of RNA polymerase dynamics in living E. coli cells obtained over 6 minutes of sptPALM imaging using either UV light (left) or primed conversion (488/730 nm light, right) for super-resolution imaging.<br />Cell shapes are marked by dashed outlines, solid outlines highlight exemplary cells (red dead, orange paused, green undisturbed) which are also marked in the following brightlight images. The brightlight images depict cell growth after sptPALM over several hours. Whereas UV-imaged cells are highly affected (left), cells imaged by primed conversion (right) continue to grow normally. Scale bars 1 μm (sptPALM), 5 μm (brightlight).</p> Bild vergrößern

Single-molecule trajectories of RNA polymerase dynamics in living E. coli cells obtained over 6 minutes of sptPALM imaging using either UV light (left) or primed conversion (488/730 nm light, right) for super-resolution imaging.
Cell shapes are marked by dashed outlines, solid outlines highlight exemplary cells (red dead, orange paused, green undisturbed) which are also marked in the following brightlight images. The brightlight images depict cell growth after sptPALM over several hours. Whereas UV-imaged cells are highly affected (left), cells imaged by primed conversion (right) continue to grow normally. Scale bars 1 μm (sptPALM), 5 μm (brightlight).

Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Pantazis am ETH Zürich hat 2015 einen neuen Photokonversionsmechanismus beschrieben, der sich gezielte Konversion [primed conversion] von Dendra2 nennt. Normalerweise durchläuft Dendra2, nachdem es UV-Licht ausgesetzt wird, eine Konversion von grün nach rot. Mit der neuen Methode jedoch konnte die anfängliche grüne Fluoreszenz von Dendra2 durch den Einsatz einer Kombination von blauem und nahinfrarotem Licht, die anstelle des UV-Lichts verwendet wird, zu roter Fluoreszenz konvertiert werden. „In unseren Experimenten, bei denen wir PALM einsetzen, verfolgen wir oft einzelne mit Leuchtmittel markierte Proteine mittels PALM-Einzelpartikelverfolgung. Deswegen haben wir große Probleme mit Zellen, die während der Experimente absterben. Als wir dann diese wissenschaftliche Arbeit lasen, fragten wir uns, ob die gezielte Konversion in der hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie mit PALM-Einzelpartikelverfolgung eingesetzt werden könnte“, erklärt Dr. Endesfelder.

Nun beschäftigte sich die Forschungsgruppe von Dr. Endesfelder am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie eingehender mit diesem neuen Mechanismus. In ihrer vor Kurzem erschienenen Veröffentlichung demonstrieren die Forscher, dass die gezielte Konversion erfolgreich zur PALM-Einzelpartikelverfolgung in lebenden Zellen eingesetzt werden kann. Verglichen mit der Photokonversion mittels UV-Lichts ist die Phototoxizität, die durch gezielte Konversion erzeugt wird, bei der Bildgebung der Dynamik einzelner Proteine in Escherichia-coli-Zellen stark reduziert. Tatsächlich wuchsen Zellen, bei denen eine PALM-Einzelpartikelverfolgung mithilfe von gezielter Konversion durchgeführt wurde, weiterhin ohne negative Effekte, wohingegen bei Zellen, bei denen UV-Licht bei der PALM-Einzelpartikelverfolgung eingesetzt wurde, das Wachstum fast gänzlich aussetzte. Zudem zeigte die Forschungsgruppe um Endesfelder, dass hauptsächlich ein einzelner Aminosäurerückstand, genauer gesagt das Arginin 66, das mit dem Chromophor interagiert, die Fähigkeit des Proteins zur gezielten Grün-Rot-Konversion steuert. Mithilfe dieser Erkenntnisse modifizierte Endesfelders Forschungsgruppe die weit verbreiteten fluoreszierenden Proteine Eos, KikGR und pcDronpa, um diesen die Fähigkeit zu verleihen, eine gezielte Konversion zu durchlaufen.

Weitere Quellen

B. Turkowyd, A. Balinovic, D. Virant, H. G. Gölz Carnero, F. Caldana, M. Endesfelder, D. Bourgeois, U. Endesfelder. A general mechanism of photoconversion of green-to-red fluorescent proteins based on blue and infrared light reduces phototoxicity in live-cell single-molecule imaging, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 10.1002/anie.201702870.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201702870/epdf

 

 

 

 
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